BloodRayne: Betrayal leva a série de volta ao estilo clássico do Side Scroller em duas dimensões.No game, o jogador assume mais uma vez o papel de Rayne, uma damphyr (ou seja, filha de uma relação entre vampiros e humanos) que é dotada de força e habilidade sobrenaturais. Assim como os vampiros, no entanto, a protagonista foi amaldiçoada pela fraqueza à luz solar e a sede insaciável por sangue.
Neste game, Rayne é recrutada pela Brimstone Society — uma instituição formada por caçadores de vampiros — para uma última missão. Para ajudá-la nessa tarefa, ela pode contar com as duas lâminas que são a sua marca registrada e muitos golpes especiais.
Durante a aventura, a guerreira terá de resolver diversos enigmas entre as fases ao mesmo tempo em que busca atravessar pelos ambientes da forma mais ágil possível. No meio do caminho outros personagens também aparecer, adicionando ainda mais elemento à intrincada saga de Rayne.